為期 20 年的實驗走到盡頭
經過 30,947 次核移植嘗試，並以複製方式從一隻雌鼠繁衍出逾 1,200 隻小鼠後，日本研究團隊結束了一項歷時約 20 年的實驗。第 58 代出生的 5 隻小鼠全在隔天死亡，終結了研究人員曾以為可能無止境延續的世代鏈。
目錄
這項實驗於 2005 至 2025 年進行，發現反覆複製會使有害的 DNA 變化逐漸累積。繁殖成功率起初有所提升，從第一代約 7% 上升至第 26 代的 15.5%。自第 27 代起，成功率開始下滑，最終降至 0.6%，也就是每 1,000 個移植到代理母鼠體內的複製胚胎，約有 6 隻出生。
研究結果刊載於《Nature Communications》，論文題為連續複製的限制。山梨大學在其研究公告中列出參與研究的人員，包括副教授若山清香，以及該校先進生物技術中心主任、教授若山照彥。
最能揭示問題的結果，是外觀與繁殖能力之間的落差。複製世代中的許多小鼠看起來健康，壽命也約有兩年，但後代無論透過複製或自然交配，繁殖都愈來愈困難。
山梨大學小鼠複製研究先驅若山照彥，以一個熟悉的比喻說明這項實驗背後的疑問：
用影印機複製一張圖片，影像品質會稍微下降。再複製那張副本，品質就會更差，
對這些小鼠而言，變化既涉及個別 DNA 字母，也涉及大得多的染色體片段。研究將這些逐漸累積的變化，與出生成功率最終崩跌連結起來。
研究人員如何複製複製鼠
研究團隊採用體細胞核移植。體細胞是身體細胞，並非卵子或精子。研究人員取出含有細胞大部分遺傳指令的細胞核，將其移植到一個已移除自身細胞核的未受精卵中。
接著，卵子必須重新設定這些指令，讓來自成年體細胞的細胞核能引導胚胎發育。研究人員將形成的胚胎移植到代理母鼠體內，再以存活複製鼠的細胞培育下一代。
供體細胞取自卵丘細胞，這些細胞會包圍並支援卵子。最初的供體是一隻雌鼠，具有刺鼠色毛皮；這種毛色是由單根毛髮上的色素帶所形成。所有複製小鼠皆為雌性，也都具有這種毛色。
研究人員每年培育約三至四代。他們並非每次都直接使用最初供體儲存的細胞製作小鼠，而是反覆讓世代血脈經由新複製的動物延續。這種設計讓他們得以追蹤從一代傳至下一代的變化。
為何初期結果看來前景看好
理化學研究所（RIKEN）在2013 年 3 月的公告中表示，當時實驗仍朝令人鼓舞的方向發展。論文投稿時，研究團隊已培育出 25 代共 581 隻小鼠；截至公告發布時，則已培育出 26 代共 598 隻。
研究人員使用曲古抑菌素 A（TSA），這種藥物有助於移植的細胞核重新設定基因活性。先前反覆複製小鼠的嘗試最多只達約 6 代。加入 TSA 並改善實驗條件後，出生成功率不但沒有持續下滑，反而有所上升。
當時對健康、生育能力、壽命及染色體末端的測量結果也令人安心。因此研究人員相信，這個過程或許能無止境地延續。再追蹤同一血脈十年，則揭露了最初 25 代期間尚未顯現的問題。
幾個重要里程碑顯示研究結論如何改變：
- 2005 年：開始連續複製。最終論文將起始時間定為 1 月；RIKEN 在 2013 年的說明則指出是在年底。
- 2013 年 3 月 8 日：RIKEN 公告已培育出 26 代共 598 隻小鼠，出生成功率約達 15%。
- 第 27 代起：儘管各代之間有所波動，出生成功率仍開始持續下滑。
- 2025 年：實驗於第 58 代結束，該代出生的 5 隻小鼠全在隔天死亡。
DNA 內部發生了什麼變化？
基因組定序發現，第一代至第 57 代之間約累積 3,700 個單核苷酸變異，以及 80 個小型插入或缺失。單核苷酸變異（SNV）是 DNA 序列中單一字母的變化；插入或缺失則是增加或移除一小段序列。
論文計算出每代平均有 69.4 個 SNV，以及 1.4 個小型插入或缺失。許多 DNA 變化影響不大，但有些會干擾正常發育或繁殖所需的指令。
作為比較，研究人員檢視了兩個透過兄妹交配維持 60 代、歷時約 20 年的小鼠品系。這些品系每代平均累積 22.3 個 SNV。因此，複製血脈的變異率約為其 3.1 倍，計算依據為 69.4 與 22.3 的比較。
預測會破壞或改變蛋白質的微小變異比例也有所增加。第一代至第 23 代間出現的變化中，這類變異占 0.52%；第 23 代至第 57 代間出現的變化中，比例則升至 1.19%。
研究人員也根據小鼠 DNA 重建家族樹。結果與實驗記錄的世代血脈相符，確認整條血脈在實驗期間始終源自最初的供體。
較大型的染色體變化加重負擔
小鼠累積的不只是個別 DNA 字母的變化。定序結果顯示，第一代至第 57 代間約出現 80 至 84 個新的結構變異，也就是 DNA 排列方式或含量發生較大幅度的變化。
其中 16 個大型變異涉及至少 40,000 個 DNA 字母的片段。變化包括少了一條 X 染色體、第四號染色體發生重大改變，以及第七號與第九號染色體之間的物質交換。
研究人員估計，到第 57 代時，約有 30 個突變導致基因功能喪失，另有約 50 個突變改變了基因所編碼的蛋白質指令；這些估計尚未計入少了一條 X 染色體的影響。此外，兩個大型缺失也影響相同區域，導致名為 Csmd1 的基因兩個拷貝都喪失功能。
作者將出生率下滑歸因於突變的累積負擔。他們的解釋是，實驗末期進一步出現的有害變化，使原本已大幅改變的基因組超出發育中小鼠所能承受的範圍。
較高突變率的成因仍未釐清。反覆移植體細胞核可能有所影響，而體細胞也可能在動物一生中累積突變。缺乏一般有性生殖，也會改變這些突變在世代間傳遞的方式。
為何重新設定基因活性仍不足夠
複製不只是把 DNA 移入卵子。卵子還必須重新設定有助於決定哪些基因會啟動的化學標記。這些標記稱為表觀遺傳標記，因為它們會調節 DNA 的使用方式，卻不會改變 DNA 序列。
研究人員原先懷疑，這項重新設定過程若未能順利完成，可能會隨著每輪複製而惡化。但測量結果顯示，後期出生率下滑的主要原因較可能是 DNA 突變不斷累積。
複製小鼠的胎盤較大，這是小鼠複製已知的特徵。整項實驗中，胎盤平均重約 0.30 公克，對照組透過體外受精產生的小鼠則為 0.11 公克。不過，胎盤重量並未隨複製世代增加而持續上升。
研究人員檢測早期胚胎中的數種表觀遺傳標記，發現新培育的複製鼠與第 51 代複製鼠大致相似。TSA 仍有助益：第 51 代在接受治療後的出生成功率為 5.4%，未接受治療則為 1.6%。
染色體末端的保護性 DNA 序列端粒，也曾被視為另一種可能的解釋。後期定序分析未發現充分證據，證明受檢視的世代間端粒有大幅縮短。綜合各項檢測結果，研究人員將注意力轉向 DNA 序列與染色體結構中不斷增加的變化。
外表健康的小鼠後代較少
自然交配揭露了從外觀不易察覺的生殖能力下滑。第 20 代雌鼠與正常雄鼠交配後，每胎平均產下 9.9 隻幼鼠，接近對照組的 10.3 隻。
之後，每胎平均產仔數降至第 50 代的 2.8 隻，以及第 55 代的 2.2 隻。以每胎 2.2 隻與 10.3 隻相比，後者比對照組平均值低約 79%。
隨著複製世代增加，經荷爾蒙刺激後採集到的卵子數量並未減少。因此，研究人員進一步檢視卵子活化或受精後的發育情況。
在實驗室中以正常雄鼠的精子讓卵子受精後，對照組有 97.6% 的胚胎發育至囊胚期，也就是著床前的一個早期階段。第 25 代複製鼠卵子的比例為 39.7%，第 53 代則為 20.3%。
以第 56 代卵子進行的實驗發現，細胞核與細胞質，也就是細胞核周圍的物質，都有問題。即使將其中一部分替換成對照組卵子的相應部分，發育率仍然很低。卵子的兩個部分看來都受到損害。
有性生殖恢復部分生育能力
部分晚期複製世代的後代存活下來，繁殖能力也較佳。第 55 代複製雌鼠每胎平均產下 2.2 隻幼鼠，但牠們的後代每胎平均產下 7.0 隻，超過三倍。
這些孫代的胎盤大小也接近透過受精形成的胚胎，而非複製小鼠常見的胎盤增大情形。
卵子與精子形成時，有性生殖會重新組合遺傳物質；受精時則會將其與另一個親代的 DNA 結合。一個親代提供的正常基因拷貝，有時能彌補另一親代受損的拷貝。遺傳問題嚴重的胚胎可能停止發育，而遺傳組合尚可的胚胎則能存活。
後代仍會遺傳複製雌鼠的突變。基因組定序在子代與孫代中都發現了變異，包括第七號與第九號染色體之間的交換。研究人員推測，兩條改變過的染色體是一起遺傳，因此這項交換維持了平衡。
因此，產仔數增加顯示有性生殖讓生育能力部分恢復。後代的繁殖能力有所改善，但仍帶有複製過程中累積的部分遺傳變化。
對保育與畜牧的意義
保存的細胞可留存已死亡或無法繁殖動物的遺傳物質，因此複製受到保育人士關注。在畜牧業中，複製則可用來繁殖具有受重視特徵的動物。這項實驗顯示，這些用途必須留意供體 DNA 的狀況，以及後代的生殖健康。
研究結果針對的是透過長串連續供體反覆複製的情況。58 代是這個特定小鼠血脈在此實驗條件下的終點；其他血脈或哺乳動物物種可達到的世代數仍未知。
未參與這項研究、任職於加州大學戴維斯分校的發育內分泌學家 Katarzyna Malin 表示，研究結果支持透過保育避免物種陷入危機，而非等到危機發生後才依賴複製來拯救牠們。
保育組織 Revive & Restore 的 Ben Novak 指出，動物一生中在身體組織累積的突變值得關注。供體細胞帶有自身的 DNA 變化歷程；當這個細胞成為另一隻動物的起點時，這點便十分重要。
這項研究帶出兩項實際啟示。複製能讓人們在多個世代中保留取得某隻動物遺傳物質的方式，但要維持健康後代，也取決於 DNA 隨時間如何變化。在這項實驗中，複製血脈幾近終結時，自然交配讓部分後代恢復了生育能力。
重點整理
- 研究人員進行 30,947 次核移植嘗試，透過連續複製，從一隻原始雌鼠培育出逾 1,200 隻小鼠。
- 出生成功率在第 26 代達到 15.5% 的高峰，之後下滑至實驗末期的 0.6%。
- 第 58 代出生的 5 隻小鼠全在隔天死亡，這條世代血脈於 2025 年終結。
- 與透過兄妹交配維持的小鼠品系相比，複製血脈每代累積的單一 DNA 字母變化約為其三倍。
- 有害 DNA 突變與大型染色體變化不斷累積，但測得的表觀遺傳異常並未逐代惡化。
- 有性生殖改善了部分後代的生育能力，但遺傳的突變仍然存在。
